Immunohématologie moléculaire à la Société canadienne du sang Génotypage d’antigènes érythrocytaires

Auteur: Mindy Goldman, MD, FRCPC
Révision (2016) : Kirsten Hannaford, MLT; Judith Hannon, MD, FRCPC; et Philip Berardi, MD, PhD, FRCPC
Mise en ligne: 2016

Table des matières

• Introduction
• Plateformes de génotypage de groupes sanguins érythrocytaires
• Indications pour le génotypage
• Résultats discordants entre le génotypage et le phénotypage
• Cas représentatifs
• Formulaires de demande d’échantillons
• Exigences relatives à l’envoi des échantillons
• Références

Introduction

L’immunohématologie moléculaire désigne la détection de la base moléculaire génétique d’un antigène, plutôt que de la détection de l’antigène proprement dit. Dans les laboratoires cliniques, la réalisation d’analyses moléculaires nécessite une connaissance de la base moléculaire des antigènes des groupes sanguins. Il faut aussi disposer de méthodes de génotypage appropriées pouvant être utilisées en laboratoire. Les analyses moléculaires ont essentiellement remplacé le typage sérologique des antigènes du système HLA, lesquels sont extrêmement polymorphes. Des techniques de génotypage à grande échelle sont utilisées pour les registres de donneurs non apparentés, tels que celui du Réseau UniVie de la Société canadienne du sang. Le typage moléculaire peut également être utilisé pour les systèmes antigéniques des plaquettes et des neutrophiles, puisque la base génétique de ces systèmes est définie. Cela peut s’avérer particulièrement utile puisque les antisérums commerciaux servant au typage d’un grand nombre de ces systèmes ne sont pas aisément disponibles.

Le génotypage érythrocytaire est de plus en plus utilisé en médecine transfusionnelle.^1,3 Un grand nombre des antigènes érythrocytaires sérologiquement définis sont liés à des polymorphismes mononucléotidiques (SNP ou single nucleotide polymorphisms), qui entraînent une différence d’un seul acide aminé dans les antigènes érythrocytaires. Cependant, selon le système sanguin, la relation entre le gène de l’antigène érythrocytaire et l’antigène correspondant peut être assez complexe. Par exemple, dans certains systèmes antigéniques comme le système ABO, de nombreux allèles peuvent coder pour le même phénotype. D’autres phénomènes moléculaires, différents des SNP survenant dans la région du gène codant pour ces antigènes, peuvent également engendrer des antigènes érythrocytaires ou affecter l’expression des antigènes.^1,3 Il peut s’agir de changements nucléotidiques dans les sites d’épissage ou dans le site de liaison des facteurs de transcription nécessaires à l’expression du gène, de la délétion ou de l’insertion de gènes, ou encore de phénomènes liés à une recombinaison génétique. Par conséquent, un génotypage ciblé et un phénotypage peuvent donner des résultats différents. Au fur et à mesure que de nouvelles données sont disponibles, les fabricants modifient leurs trousses d’essai dans le but de déceler les variations génétiques les plus fréquentes. Par exemple, les plateformes de génotypage Duffy (Fy) décèlent plusieurs polymorphismes mononucléotidiques (SNP) qui influencent l’expression des antigènes Fy^a et Fy^b : un SNP dans l’exon 2 du gène Duffy qui code directement pour les antigènes Fy^a ou Fy^b, un SNP dans le site promoteur du gène Duffy qui prévient l’expression du gène FYB dans les érythrocytes, mais pas dans d’autres tissus (mutation GATA-1) et des SNP dans l’exon 2 qui influencent la traduction et la stabilité de l’antigène Fy^b, Fyx.⁴

Le génotypage des antigènes érythrocytaires compte de nombreuses applications dans le dépistage des donneurs de sang, ainsi que dans divers contextes diagnostiques. Au Canada, les plateformes de génotypage à haut débit des érythrocytes ainsi que les trousses d’essai associées sont homologuées par Santé Canada pour l’évaluation des antigènes érythrocytaires. Le génotypage peut ainsi être considéré comme un complément fiable aux dépistages sérologiques et sera amené à devenir de plus en plus utilisé pour l’affectation des antigènes érythrocytaires. Si, toutefois, on obtenait des résultats divergents entre un génotypage et un phénotypage, il faudrait faire d’autres analyses. Ces résultats contradictoires devraient faire l’objet d’une discussion avec le spécialiste en médecine transfusionnelle de votre hôpital ou avec le Laboratoire d’immunohématologie national de référence (LINR) de la Société canadienne du sang. Le présent article se concentre sur l’utilisation du génotypage moléculaire au LINR (détermination non RHD) et au laboratoire de services diagnostiques d’Edmonton de la Société canadienne du sang (détermination RHD). Les demandes de génotypage non RHD sont traitées à l’aide du système ID CORE XT^TM de Progenika, distribué par Grifols, alors que les demandes de génotypage RHD sont effectuées à l’aide de la technologie RHD BeadChip^TM de BioArray Solutions, distribuée par Immucor. Ces systèmes sont tous les deux agréés par Santé Canada. À noter également que d’excellentes synthèses traitent de l’utilisation du génotypage pour d’autres indications, telles que la détermination du groupe sanguin fœtal et le typage des donneurs.^1-3

Plateformes de génotypage de groupes sanguins érythrocytaires

Pour le génotypage non RHD, le système ID CORE XT^TM de Progenika utilise la plateforme Luminex.⁵ La technologie Luminex consiste en un cytomètre en flux modifié qui utilise des sondes oligonucléotidiques fixées à des microsphères. Ce système est aussi utilisé pour le génotypage des antigènes leucocytaires humains (HLA) et des antigènes plaquettaires humains (HPA). Il est hautement automatisé et comprend un logiciel d’analyse intégré.⁶ Les échantillons sont analysés par petits lots à la suite d’un processus automatisé d’extraction de l’ADN. Le laboratoire doit être informé des échantillons urgents afin que ceux-ci puissent être traités en priorité. Le tableau 1 présente les antigènes des groupes sanguins décelés à l’aide du système ID CORE XT^TM. Les allèles respectifs analysés sont énumérés dans le rapport de génotypage (voir les exemples de cas représentatifs).

Tableau 1. Allèles et antigènes testés par ID CORE XT

Le génotypage RHD des échantillons de patients sélectionnés peut être réalisé par notre laboratoire de services diagnostiques d’Edmonton à l’aide de la trousse BioArray BeadChip™ d’Immucor, qui permet d’identifier différents variants du gène RHD qui sont cliniquement significatifs et responsables de l’expression normale, altérée ou absente de l’antigène érythrocytaire RhD humain. Il s’agit d’un test qualitatif qui utilise une technologie propriétaire, l’analyse multiplexée médiée par allongement des polymorphismes (elongation-mediated multiplexed analysis of polymorphisms ou eMAP^®), dans le but de déterminer l’état des allèles. Le Array Imaging System (AIS) de BioArray Solutions permet de capturer des images ainsi que les signaux fluorescents émis par des billes individuelles dans la matrice BeadChip^TM. Elle permet d’identifier 68 variants génotypiques, dont plusieurs phénotypes RhD faibles et partiels. Le tableau 2 ci-dessous récapitule les antigènes érythrocytaires qui peuvent être détectés à l’aide de cette trousse, tandis que la figure 1 contient les noms BeadChip associés aux variants RHD. Ce système est également agréé par Santé Canada.

La Société canadienne du sang offre d’autres services de génotypage, notamment avec la technologie BLOODchip^TM de Progenika qui permet de détecter 58 variants ABO et plus de 110 variants alléliques codant pour les phénotypes RhD+, D-, D faible, D partiel et Del. Le laboratoire doit être informé de toute demande urgente. Les délais de traitement varient entre 7 et 14 jours. 

Figure 1. Variants RHD

Indications du génotypage

Le tableau 3 ci-dessous récapitule les indications du génotypage en contexte prénatal ou pour les patients nécessitant une transfusion, dont les échantillons peuvent être envoyés au LINR ou au laboratoire de services diagnostiques d’Edmonton. Les demandes de génotypage doivent comprendre un résumé des études sérologiques qui ont déjà été réalisées. En cas de doute, communiquez avec le LINR ou le laboratoire de services diagnostiques d’Edmonton avant d’envoyer les échantillons.

Le génotypage peut s’avérer utile dans un grand nombre de situations où le phénotype ne peut être déterminé au moyen de méthodes sérologiques.^1-3 En pédiatrie notamment, les patients atteints de syndromes, tels que la thalassémie majeure et l’anémie de Blackfan-Diamond, peuvent ne pas avoir subi d’épreuves de phénotypage avant de devoir recevoir des transfusions de façon régulière. Le génotypage permet de transfuser à ces patients des unités compatibles partiellement phénotypées pour prévenir l’allo-immunisation. Le génotypage peut aussi servir à l’interprétation de résultats sérologiques complexes chez les patients qui n’ont pas subi d’épreuves de phénotypage prétransfusionnelles et qui ont développé de nouveaux allo-anticorps. De façon similaire, il peut s’avérer plus facile de fournir des transfusions fréquentes aux patients qui ont une anémie hémolytique auto-immune, un autoanticorps circulant et un TDA positif malgré une chimiothérapie si l’on peut prédire un phénotype à partir du génotypage. Enfin, le génotypage peut être utilisé pour confirmer le phénotype lorsqu’aucun antisérum commercial n’est disponible pour le typage de certains systèmes antigéniques, comme le système Dombrock. 

Les patients atteints d’anémie falciforme peuvent présenter une variété de difficultés transfusionnelles. Certains de ces patients nécessiteront une thérapie transfusionnelle chronique et présenteront un taux élevé d’allo-immunisation. Étant donné que les variants alléliques RHCE et RHD sont plus communs chez ces patients et certains groupes ethniques, le génotypage pourrait aider à optimiser l’approche transfusionnelle grâce à l’identification de ces variants. À noter que près de 67 % des Afro-Américains présentent le phénotype Fy (a- b-) en raison d’une mutation dans le site de liaison GATA-1, qui empêche l’expression de l’antigène Fy^b dans les érythrocytes, mais pas dans les autres tissus. Étant donné que la glycoprotéine Fy^b est tout de même présente dans de nombreuses cellules de l’organisme, ces personnes ne produisent pas d’anti-Fy^b. L’abandon des exigences en matière d’unités Fy (b-) pourrait faciliter l’approvisionnement en érythrocytes de phénotype compatible pour les autres systèmes antigéniques.⁷

Indications pour la détermination du RHD

Le génotypage RHD peut s’avérer utile en contexte prénatal pour les patientes qui présentent un phénotype D faible, variable ou non concordant à la suite des épreuves de typage D prénatales courantes. Chez les personnes d'origine caucasienne, environ 80 % des personnes qui présentent un phénotype D faible sont de type 1, 2 ou 3.^8-11 Ces personnes sont peu susceptibles de développer une allo-immunisation RhD. Récemment, le College of American Pathologists et le groupe de travail de l’AABB sur le génotypage RHD se sont réunis pour élaborer des recommandations sur la gestion des patients présentant un phénotype D faible.¹² À l’issue de cette réunion, ils ont recommandé que le génotypage RHD soit introduit progressivement pour les patients présentant un phénotype D faible. Ils ont également recommandé que, pour les besoins transfusionnels et prophylactiques (immunoglobuline Rho), l’on considère que les patients qui présentent un phénotype D faible de type 1, 2 ou 3 ont un rhésus positif.

Le génotypage RHD est aussi indiqué chez les patients ayant obtenu des résultats D discordants. Par exemple, un patient qui semble D positif, mais qui présente des anticorps anti-D. Il pourrait s’agir d’une personne D partiel ayant un allo-anticorps ou une personne D+ ayant un autoanticorps.¹³ Les hôpitaux qui n’arrivent pas à déterminer le phénotype D peuvent demander un génotypage RHD au laboratoire de services diagnostiques d’Edmonton en envoyant un échantillon.

Résultats discordants entre le génotypage et le phénotypage

Il peut arriver que le phénotype déduit à l’aide des données de génotypage ne corresponde pas aux résultats du phénotypage réalisé à l’aide de méthodes sérologiques. Cela peut arriver, entre autres, dans les cas où les réactifs sérologiques sont incapables de détecter des variants avec expression partielle de l’antigène ou encore des variants non interrogés par la technologie de génotypage utilisée. Dans pareils cas, où il convient de procéder au cas par cas, il peut être nécessaire de pousser l’investigation et d’inclure le séquençage génétique ciblé

Cas représentatifs

Cas n^o 1 : John Doe est hospitalisé après avoir reçu un diagnostic d’hémorragie gastro-intestinale. Son taux d’hémoglobine est de 80 g/l. Trois semaines auparavant, on lui avait transfusé quatre unités de globules rouges. Les résultats des tests de dépistage des anticorps et du TDA de John Doe sont positifs et une analyse révèle la présence d’anti-C, d’anti-K et d’un anticorps non identifié. Un échantillon est envoyé au LINR afin qu’un génotypage soit réalisé à l’aide de la trousse ID CORE XT^TM. Les résultats sont présentés dans la figure 2.

Figure 2. Rapport de phénotypage des érythrocytes pour le cas n^o 1

Cas n^o 2 : Jane Doe est dans son premier trimestre de grossesse. Un groupage sanguin de routine avec recherche d’agglutinines irrégulières (RAI) est réalisé et donne une réaction faible à l’anti-D utilisé couramment à l’hôpital. Le personnel de l’hôpital refait le test avec le même anti-D et augmente la durée de l’analyse à température ambiante à 5 minutes (tel que cela est décrit dans la notice d’accompagnement du produit). Les résultats initiaux sont confirmés. Deux anti-D d’autres fabricants sont mis à l’essai et on observe une réaction variable avec les globules rouges de la patiente, alors que les échantillons de contrôle réagissent conformément aux attentes. La politique de l’hôpital est de traiter les patients D faibles de type 1, 2 ou 3 comme étant RhD+. Ces patients ne reçoivent pas d’immunoglobuline Rho (D). Un échantillon est envoyé au laboratoire de services diagnostiques d’Edmonton afin qu’un génotypage RHD soit réalisé. Pour ce faire, le laboratoire utilise le système BeadChip de BioArray Solutions. Les résultats sont présentés dans la figure 3.

Figure 3. Rapport de génotypage pour le cas n^o 2

Formulaire de demande de génotypage (non RHD)

Vous trouverez ci-dessous un exemple de formulaire de demande de génotypage pour patients. Celui-ci est accessible sous sa forme la plus récente au www.blood.ca/en/hospitals/ottawa-reference-laboratory.

Formulaire de demande de génotypage (RHD)

Vous trouverez ci-dessous un exemple de formulaire de demande de génotypage RHD. Celui-ci est accessible sous sa forme la plus récente au www.blood.ca/sites/default/files/Request_for_RHD_Genotyping.pdf

Références

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